Мікроскопія була і залишається важливим методом аналізу мікросвіту

Мікроскопія була і залишається важливим методом аналізу мікросвіту
з того часу, коли А.Левенгук вперше описав амеби та інші мікроорганізми. "Складний мікроскоп", тобто, мікроскоп з більш ніж однією лінзою, був винайдений до того, як з’явилися перші повідомлення про існування живих мікроорганізмів. З того часу мікроскоп зазнав численних удосконалень. Найбільш значущими подальшими технічними досягненнями для вивчення мікросвіту є: винахід електронного мікроскопа (1932 р.), метод фазового контрасту (1935 р.), винаходи конфокального мікроскопа (1955 р.), атомно-силового мікроскопа (АСМ) (1986 р.), флуоресцентного мікроскопа (2006 р.) та їх похідних.

Винайдення мікроскопа, такого важливого для всіх галузей науки приладу, зумовлено, насамперед, розвитом оптики. І хоча деякі оптичні властивості вигнутих поверхонь були відомі ще Евкліду (300 років до н.е.) і Птоломею (127-151 рр.), проте їх збільшувальна здатність не знайшла практичного застосування. У зв'язку з цим перші окуляри були винайдені Сальвінія діли Арлеаті в Італії лише в 1285 р. У 16 столітті Леонардо да Вінчі і Мауроліко показали, що малі об'єкти краще вивчати за допомогою лупи.
Першими винайденими людством мікроскопами є оптичні мікроскопи. Але їх винахідника не так вже й просто назвати. Ранні відомості про мікроскоп відносять до 1590 р. і міста Мідделбург (Нідерланди) та пов’язують з іменами І. Ліпперсгея (розробив перший простий оптичний телескоп) і З. Янсена, які займалися виготовленням окулярів.

Винахід полягав у тому, що було змонтовано дві опуклі лінзи всередині однієї трубки, тим самим заклали основи для створення складних мікроскопів. Фокусування на досліджуваному об'єкті досягалося за рахунок висувного тубуса. Такий мікроскоп збільшував зображення від 3 до 10 разів. Це був справжній прорив у вивченні мікросвіту!

У цей період (XVI ст.) датські, англійські та італійські дослідні прилади поступово почали свій розвиток, закладаючи фундамент сучасної мікроскопії.
Швидке поширення і вдосконалення мікроскопів почалося після того, як Галілей, удосконалюючи сконструйовану ним зорову трубу, став використовувати її як своєрідний мікроскоп (1609-1610), змінюючи відстань між об'єктивом і окуляром. Пізніше, у 1624 р., добившись виготовлення більш короткофокусних лінз, Галілей значно зменшив габарити свого мікроскопа. Цей мікроскоп збільшував у 35-40 разів.

У 1625 р. членом Римської "Akudemia dei lincei" І. Фабером був запропонований термін "мікроскоп". Перші успіхи, пов'язані із застосуванням мікроскопа в наукових біологічних дослідженнях, були досягнуті Р. Гуком, який вперше описав рослинну клітину (1665 р.).

У 1681 р. Лондонське королівське товариство в своєму засіданні детально обговорювало, як голландець А. Левенгук описував дивовижні речі, які відкривав своїм мікроскопом у краплині води, в настоянці перцю, в намулі річки та ін. Він виявив і замалював сперматозоїди різних найпростіших, деталі будови кісткової тканини (1673-1677).

Кращі лупи Левенгука збільшували в 270 разів! З ними він вперше побачив кровоносні тільця, рух крові в капілярних судинах хвоста пуголовка, смугастість м’язів, відкрив інфузорії. Левенгук перший занурився у світ мікроскопічних одноклітинних водоростей та бачив навіть бактерії. Але тоді не було ще й віддаленої можливості зрозуміти ні значення бактерій для людини, ні сенсу хлорофілу, ні багатьох інших речей.

У 1668 р. Є. Дівіні, приєднавши до окуляра польову лінзу, створив окуляр сучасного типу. У 1673 р. Я. Гевелій увів мікрометричний гвинт, а Х.Гертель запропонував під столик мікроскопа помістити дзеркало (1716). Таким чином, мікроскоп стали монтувати з тих основних деталей, які входять до складу сучасного біологічного мікроскопа.

У 1824 р. проста практична ідея Салліга, відтворена французькою фірмою Шевальє закріпила величезний успіх мікроскопа. Об'єктив, який раніше складався з однієї лінзи, розчленований на частини, почали виготовляти з багатьох ахроматичних лінз. Вперше стало можливим говорити про справжні великі збільшення - в 500 і навіть 1000 разів. Межа граничного бачення пересунулася від двох до одного мікрона.

У 70-х роках XIX століття оптична мікроскопія переможно рушила вперед.
З 1866 р. розпочалася сумісна робота Е.Аббе і К.Цейса. Сформований штаб вчених, оптиків і обчислювачів, які працюють при майстерні Цейса. Розроблена теорія і вироблені принципи, що визначають межу роздільної здатності мікроскопа. Дифракційна теорія Аббе стверджувала, що не можна бачити об'єкти менші, ніж половина довжини хвилі і не можна отримати зображення менші половини довжини хвилі, тобто менші 1/4 мікрона. Або з різними хитрощами імерсії - до 0,1 мікрона. Хвиля лімітує нас.

Праці англійського оптика Дж. Сіркса (1893) поклали початок інтерференційної мікроскопії. У 1903 р. вчені Р. Жигмонді і Г. Зідентопф створили ультрамікроскоп, а у 1911р. Ж. Саньяк описав перший двопроменевий інтерференційний мікроскоп. У 1935 р. Ф. Зерніке запропонував використовувати метод фазового контрасту для спостереження в мікроскопах прозорих об'єктів, що слабо розсіюють світло.

Сучасні світлові мікроскопи досліджують структури всередині клітин, марковані флуоресцентними зондами. Наука тепер використовує мікроскопи, що мають до 10 разів більшу роздільну здатність ніж стандартний оптичний мікроскоп, для того, щоб обійти дифракційну межу світла і бачити на молекулярному рівні структури клітин.

Декілька нових підходів, розроблених в останні роки для флуоресцентної мікроскопії, дозволили досягти розділення порядку десяти нанометрів. Методи об'єднали терміном флуоресцентна наноскопія. Німецькі вчені Ш. Хелль і М. Боссі у 2006 р. розробили метод STED (Stimulated Emission Depletion) з використанням двох лазерних променів, які впливають на флуоресцентні молекули і мікроскоп нового покоління - наноскоп, який дозволяє спостерігати об’єкти розміром біля 15 нм, тобто дозволяє зазирнути, наприклад, всередину клітини. Раніше вважалося, що це неможливо. Е. Бетціг і В. Мернер, працюючи окремо один від одного, заклали наукову базу для створення іншого методу - Single Molecule Microscopy, заснованого на можливості "вмикати" і "вимикати" флуоресцентне світіння кожної окремої молекули. Завдяки цим відкриттям стало можливо спостерігати біохімічні процеси, що відбуваються на внутрішньоклітинному рівні: переміщення макромолекул у живих клітинах, рух білків. Зокрема, стало можливо спостерігати синапси, відстежувати рух білків, пов'язаних з хворобами Паркінсона та Альцгеймера, спостерігати за поведінкою заплідненої яйцеклітини. Ш. Хелль, Е. Бетціг і В. Мернер у 2014 р. удостоєні Нобелівської премії.

Сучасні прийоми флуоресцентної мікроскопії
Конфокальна мікроскопія (КМ) – сучасний інструмент для візуалізації та дослідження внутрішньо- і позаклітинних структур та аналізу клітинних процесів у біологічних та біомедичних дослідженнях, що має в своїй основі люмінесцентний мікроскоп. Метод КМ дозволяє отримувати “оптичні зрізи” живих та фіксованих препаратів завтовшки до 100 мкм з інтервалом 0,3–0,5 мкм. Цей принцип запатентував у 1957 р. М. Мінскі.

Лазерна скануюча конфокальна мікроскопія дає можливість отримання тривимірного зображення об’єкта (так звана 3D-реконструкція). Сучасна КМ широко використовується у клітинній біології. Типові задачі КМ – дослідження цитоскелету, ядра, хромосом і навіть локалізації в них генів. При дослідженні локалізації білків у клітинах їх попередньо мітять флуорохромами, це дозволяє диференціювати їх навіть якщо вони знаходяться один під одним. Вивчаються також динамічні процеси в живих клітинах, наприклад рух іонів кальцію та інших речовин через клітинні мембрани.

Мультифотонна мікроскопія базується на можливості двохфотонного або трьохфотонного збудження флуоресценції. За допомогою чотиривимірної мультифотонної мікроскопії вдалося спостерігати зростання та відведення аксонів, а також міграцію цілих клітин.

Новими перспективними напрямками також є такі методики мікроскопії:
FRAP ‒ Fluorescence Recovery After Photobleaching ‒ використовують для дослідження рухливості біоорганічних молекул шляхом ініціації фотохімічного розкладання флуорохрома в зоні опромінення й наступного його роз’єднання з молекулами.

FRET ‒ Fluorescence Resonance Energy Transfer – використовується для визначення відстані між молекулами різних типів, їх оточення і взаємодії.
TIRF ‒ Total Internal Reflection Fluorescence або мікроскопія згасаючого поля ‒ забезпечує висококонтрастні флуоресцентні зображення з низьким рівнем шумів і є ідеальною для візуалізації й спектроскопії флуоресценції окремих молекул. Метод може використовуватися для дослідження везикул, переміщення окремих білків у клітинах, поглинання білків крові біоматеріалами, адгезії клітин до різних поверхонь, а також динаміки вивільнення нейромедіаторів і для характеристики груп наночастинок, переносу електронів у мітохондріальних і фотосинтетичних мембранах, а також сил, які діють на поверхню під час переміщення клітин.

FLIM – Fluorescence Lifetime Imaging Мicroscopy ‒ базується на вимірюванні часу життя флуоресценції в кожній точці просторового зображення. Метод дозволяє не тільки оцінювати взаємодію між білками, але й аналізувати локальне оточення флуорофорів, наприклад, pH середовища або концентрації різних іонів, кисню та ін.

Мікроскопія надвисокої роздільної здатності
У даний час існують ряд методів, які подолали закон Аббе.
Ймовірно, найбільш видатною технологією високого розділення є технологія STED (STimulated Emission Depletion) - метод запропонований біля десяти років тому німецькими вченими з інституту ім. M.Планка. Він передбачає використання флуоресцентного мікроскопа за умови, що досліджувана молекула при освітленні зовнішнім джерелом випромінює світло визначеної довжини хвилі внаслідок обробки спеціальним барвником. Результуюче зображення спостерігається через конфокальний мікроскоп, в якому для отримання світла від зразка використовується дуже малий отвір. Зображення формується з елементарних світлових плям, мінімальний розмір яких не може перевищувати дифракційної границі. Для зменшення ефективної ширини світлової плями було запропоновано вторинне освітлення лазерним променем визначеної частоти з визначеним просторовим розподілом інтенсивності пучка. Після цього відбувається послідовне сканування всього зразка.

Ідея випадкової послідовної активації флуорофорів лежить в основі методів STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) і FPALM (Fluorescence PhotoActivation Localization Microscopy). Даний підхід робить можливим визначення локалізації кожної флуоресцентної молекули з наноскопічною точністю. Змінюючи положення освітлюваної області можна створити "карту" розташування флуоресцентних молекул. Ефективність розділення знаходиться у діапазоні від 20 нм.
Цікавим методом є мікроскопія структурованого освітлення — SIM (Structured Illumination Microscopy), яка була використана для візуалізації повільного руху клітин.

Завдяки роботам німецьких фізиків Хелла, Стелзера та ін. був винайдений метод 4-π конфокальної мікроскопії. За допомогою системи дзеркал і призм світло поділяється на два потоки і прямує в об'єктиви, фокуси яких співпадають. Змінюючи довжину одного плеча такого інтерферометра, можна домогтися того, щоб фази двох світлових хвиль в області фокуса також співпадали. Утворюється стояча хвиля, що призводить до підвищення аксіальної роздільної здатності.

4π-STED-мікроскоп є результатом об'єднання STED- і 4-π мікроскопії. Німецьким дослідникам за рахунок суміщення цих двох методик вдалося досягти розділення порядку 30 нм. Досягнуте - найкраще на сьогодні для оптичної мікроскопії розділення (λ/ 23).

Фотоакустична мікроскопія (РAM ‒ РhotoAcoustic Microscopy) є гібридом у техніці візуалізації зображень in vivo, що акустично виявляє оптичний контраст через фотоакустичний ефект. PAM використовує слабке акустичне розсіювання в тканині й, таким чином, виходить за межі оптичної дифузії (~1 мм у м'яких тканинах). PAM може забезпечити зображення з високою роздільною здатністю в необхідних максимальних глибинах зображень до декількох міліметрів. Метод PAM продемонстрував широке біомедичне застосування уже з моменту створення.

Атомно-силова мікроскопія.
У 1986 р. був винайдений атомно-силовий мікроскоп. За допомогою атомно-силового мікроскопа одержують зображення як фізичних об'єктів, так і біологічних, хімічних об'єктів із роздільною здатністю порядку декількох нанометрів (вірусів і бактерій, атомів і молекул), вивчають взаємодію двох об'єктів: вимірюють сили тертя, пружності, адгезії, переміщують окремі атоми, осаджують чи видаляють їх з деякої поверхні.
Японські дослідники перетворили атомний силовий мікроскоп у хірургічний інструмент, за допомогою якого можна прооперувати одну єдину клітину. Вони використали іонний промінь, щоб загострити стандартний кремнієвий наконечник силового мікроскопа і перетворити його в голку довжиною 8 мкм і товщиною 200 нм. При вставленні такої голки в людську ембріональну клітину, на стінці клітини залишився "прокол" в 1 мкм. Мембрана клітини швидко повернулася до первісної форми, а голка була просунута в ядро клітини. Нова технологія дозволяє вводити молекули в певні ділянки клітин. Зокрема, ланцюжки ДНК могли б бути вставлені безпосередньо в ядро, щоб перевірити нові методи генної терапії. Також стає можливим контроль над хімічним складом клітин у режимі реального часу.